Özet
Hümik maddelerin olumsuz etkileri yatıştırıcı hareketi, tabiatta kirlilik yapan zehirli maddeleri ve bu maddelerin uygun olmayan sıcaklık, pH, tuzluluk gibi abiyotik (canlı organizmalarla alakası olmayan) stres faktörlerini azaltan bir olay şeklinde tanımlanabilmektedir. Kural olarak, bu azaltıcı hareket hümik maddelerin zehirli maddeleri uzaklaştırma özellikleri ile veya biyota (belirli bir çevredeki-ekosistemdeki bitki, hayvan ve insan hayatı) üzerindeki yararlı etkileri ile alakalıdır. Bu çalışma hümik maddelerin biyolojik hareketi anlamında biyota üzerindeki etkilerine ve bunun muhtemel mekanizmalarına odaklanmıştır. Hümik maddelerin biyota üzerindeki yararlı etkileri, hareket mekanizmalarına göre dört kategoriye ayrılmıştır:
- Canlıların gelişimi üzerine etkileri,
- Besin tedarikinin arttırılması,
- Biyokimyasal reaksiyonların katalize edilmesi,
- Anti-oksidant aktivitesi.
Yayınlanan verilerde hümik maddelerin zikredilen gerekli biyolojik fonksiyonları değerlendirilmiştir. Burada belirtilen görüş, hümik maddelerin biyolojik etki mekanizmalarını açıklamak için son zamanlarda yayınlanan birçok raporun aksine olduğunu göstermektedir. Temel neden hümik maddelerin karmaşık yapısıdır. Gözlenen etkilerin geniş değişkenliği hümik maddelerin çok fonksiyonlu olması ile açıklanabilmektedir. Hümik maddelerin tüm biyolojik etkileri, stres faktörlerinin ne olduğunu araştırmaya gerek duymadan stres şartları gözetilerek beyan edildiği sonucuna varılabilmektedir. Böylece, hümik maddeler stres faktörlerinin zararlı sonuçlarını hafifleten çevresel bir ayarlayıcı olarak düşünülebilecektir.
1. Giriş
Hümik maddeler toprağın cansız organik kısmı ve su ekosistemi kadar turba, linyit, sapropel (deniz veya göl dibinde oluşan organik maddece zengin çamur) gibi maddelerin organik kısmının da %50 ila %90’ını içeren doğal organik bileşiklerdir [1-3]. Klasik tanımlamaya göre [4], hümik maddeler “genellikle renk bakımından yeşilden siyaha değişebilen, yüksek molekül ağırlıklı ve ısıya dayanıklı doğal olarak oluşan heterojen organik maddelerin genel bir kategorisidir”. Hümik maddeler kompleks organik bileşiklerin bir karışımıdır. Suda çözünme temelinde üç kısıma ayrılmaktadırlar: (1) hümik asitler ki hümik maddelerin asidik ortamda (pH <>
Hümik maddelerin zehirli maddelerin metabolik yolu üzerine etkileri, polihidroksil polikarbonik asitlerin düzensiz polimerleri olarak düşünülen kimyasal tabiatlarıyla alakalıdır [3]. Hümik maddelerin belirgin yapısal özelliği aynı molekül içinde hem polar hem de hidrofobik çevrede var olmasıdır. Sonuç olarak, hümik maddelerin hem polar hem de hidrofobik ksenobiyotik organik bileşikleri ve inorganik iyonları bağlama özelliği vardır. Hümik maddelere bağlama işlemi ksenobiyotiklerin özelliğinde bir değişime neden olmaktadır. Hümik maddelerin bağlama özellikleri temelinde birçok çözüm teknolojileri geliştirilmiştir [17-22]. Hümik maddeler ayrıca bazı organik atıkların parçalanmasını da kolaylaştırmaktadır. Örneğin, toprakta mikroorganizmalarca parçalanmayı izleyen kimyasal hidroliz, ‘atrazine’in yok edilmesinin nedeni gösterilmektedir [23]. Hümik maddelerin ilavesi atrazine hidroliz hızının arttığını göstermiştir. Hümik maddeler fotodegradasyonu (ışın emilişi ile bir molekülün parçalanması) da etkilemektedir. Bu durum klorlanmış aromatik hidrokarbonlar, klorlanmış fenoller ve birçok diğer tarım ilaçları gibi PAH (poliaromatik hidrokarbonlar) için önemlidir [162]. Hümik madde ilavesi ile 1-aminopirene’in fotoliz hızının arttığı tespit edilmiştir [24]. Hümik asit (20-80 ppm) içeren fosfat tamponundaki (pH 7.0, 1 mM) 1-aminopyrene’ in (10 μM) birinci dereceden fotoliz hız sabiti, hümik asit bulunmayan ile kıyaslandığında beş faktör daha fazlalaşmıştır. Hümik maddeler oksijenin kolay oluşma enerjisini transfer edebilmektedir. Bir tek oksijen dolaylı fotoliz sebebi ile çürüyen organik bileşiğe hücum etmektedir. Benzer etki atrazine için de gözlenmiştir [24]. Hümik asit verilmesi ile atrazine’in fotoliz edilmesi ne kadar önemli ise fülvik asit uygulamasının da 10 günlük bir süre içinde netice vermemesi o kadar önemlidir. Bu son çalışma göstermiştir ki su dünyasındaki kondensasyon reaksiyonlarında hümik maddeler dikkate değer bir rol oynamaktadır [25]. Hümik maddelerin Knoevenagel ve Claisen-Schmidt reaksiyonlarında alifatik asitlerle karbonil bileşiklerin kondensasyonunu ivmelendiren katalist gibi hareket ettikleri tespit edilmiştir. Sonuç olarak, hümik maddeler çevredeki organik kirleticilerin kaderini etkileyebilmektedir. Ayrıca, bunların yalnızca hümik maddelerden ziyade humus-enzim kompleksleri olduğu ileri sürülmüştür. Öyle ki bu durum kararlı ve gevşek toprak sistemlerinin işletilmesi için gereklidir. Bu kompleksler topraktaki mineral ve organik reaksiyonlar arasında “geçiş noktaları” olarak düşünülmektedir [26]. Fakat, hümik maddelerin biyotayı doğrudan etkilediği de farz edilmiştir. Hümik maddelerin canlı organizmalardaki gözlenen başlıca doğrudan etkileri Tablo 1’de özetlenmiştir.
Tablo 1 şunları göstermektedir: (1) hümik maddelerin biyota üzerine yaptığı doğrudan etkiler çok değerlidir; (2) hümik maddelerin biyolojik aktivitelerini yürüten birleşik bir mekanizma yoktur. Hümik maddelerin etkileri çevresel şartlara şiddetli biçimde bağlıdır. David ve ark. [97] hümik maddelerin yararlı etkilerini bitki beslemede uygun olmayan yetiştirme şartlarında gözlemlediğini çarpıcı örneklerle göstermiştir. Dunstone ve ark. [98] kuraklık, aşırı sıcaklık, kuru rüzgar gibi şartlarda buğdayın besin iletkenliği üzerinde fülvik asitlerin çok büyük etkilerini bulmuşlardır. Aynı zamanda, bu yazarlar hem açık alanda hem de cam serada kurutulmuş bitkilerdeki tane verimi üzerine fülvik asitlerin benzer etkilerini tespit edememişlerdir. Bu durum hümik maddelerin bir başka belirgin özelliğini izah etmektedir. Hümik maddelerin detoks yapma özelliği üzerine birçok rapor sunulmasının yanında hümik maddelerin varlığında ksenobiyotiklerin artan zehirliliği üzerine de bazı veriler rapor edilmiştir [80,81, 100-102]. Hümik maddelerin lipopolisakkarit (LPS) endotoksininden (bakteri bünyesinde bulunup onun harabiyeti sonucu açığa çıkan toksin madde) sorumlu insan göbeğine ait endotalyal hücrelerin (HUVEC) bağışıklık ve iltihap giderici reaksiyonlarını bastırdığı gösterilmiştir. HUVEC’in 100 mg/L hümik madde ile ön tasfiyesi LPS’yi iki günde dikkate değer biçimde bastırmıştır. Bu işlemi 200 mg/L doz tamamen engellemiştir. Otoriteler hümik maddelerin blackfoot hastalığına neden olan potansiyel bir zehir olabileceğini iddia etmişlerdir. Fakat, hümik madde araştırmacılarının çoğunluğu endemik (Tayvan’a ait bir hastalık türü) olan blackfoot hastalığının kaynağı olarak kuyu suyunda oluşan arsenik-hümik asit kompleksini göstermişlerdir.
3- Canlı organizmalarda hümik maddelerin yararlı etkileri
Yukarıda bahsi geçen hümik maddelerin biyota üzerine olumlu etkilerini özetlemek gerekirse aşağıdaki başlıca konular önerilecektir:
- Hümik maddeler organizma gelişimini etkilemektedir. Organik karbonun bir kaynağı veya besin kaynağı olarak kullanıldığında hümik maddeler biyosentez zincirlerinin bir parçası gibi düzen kurabilmektedir. Fakat, hümik maddelerinin bitkiler üstündeki yararlı etkileri hümik maddelerin hormon benzeri aktivitelerinden gelmektedir.
- Hümik maddeler besin tedarikini çoğaltmaktadır. Hümik maddeler azot, fosfor, potasyum ve iz element alımını arttırarak bitki gelişimini düzenleyebilmektedir.
- Hümik maddeler bazı biyokimyasal reaksiyonları katalize etmektedirler. Hümik madde ile enzimlerin etkileşim mekanizması henüz yapılandırılmış değildir. Hümik maddelerin enzim uyarılma reaksiyonlarının medyatörü ve ko-oksidantı olarak hareket ettiğine dair yeterli delil yoktur. Hümik asitlerin biyokimyasal reaksiyonlarda iştirakçi olarak katılması, derinlemesine çalışılması gereken bir konudur.
- Hümik maddelerin anti-oksidant aktivitesi. Hümik maddeler kuraklık, ısı, UV ışığı ve tarım ilacı kullanımı gibi stresten kaynaklanan serbest radikalleri azaltabilmektedir. Serbest radikaller güçlü oksitleme ajanları olduklarından zarar vericidirler. Bunlar yağlara, proteinlere ve hücre içindeki DNA’ya zarar vermektedir.
3.1. Hümik Maddelerin Organizma Gelişimi Üzerine Etkileri
3.1.1. Bir besin kaynağı olarak hümik maddeler
Hümik maddeleri ayrıştırma kabiliyetine sahip mikroorganizmaların miktarı oldukça fazladır (Tablo 2). Halen hümik maddelerin dönüşüm ve kullanım mekanizmaları üzerine elverişli bilgi azdır. Aerobik şartlarda toprak mikroflorası ile iki farklı eski deponiden (çöp sahasından) elde edilen hümik asitlerin parçalanması üzerine yapılan çalışma ilginçtir [103]. Takviye besin kaynağı olarak kullanılan hümik asitle taze atık için hümik asit kullanım seviyesi %63.6 ve 12 ay sonraki bertaraf olmuş atık için %88.5 olmuştur. Hümik asit hem karbon hem de azot için tek bir kaynak olarak kullanıldığı zaman seviye %100 olmuştur. Ayrışma işlemi hümik maddelerin molekül ağırlığında azalma olması gibi özelliklerinin değişmesi ile sonuçlanmıştır. Ayrıca, FTIR spektroskopisi hümik madde yapısında bazı değişiklikleri de ortaya çıkarmıştır: COOH grubun C=O bandının tamamen bertarafı, polisakkaritlerde C-O gerilmesinin bertarafı, CH3 ve CH2 grupların emilimlerindeki güçlü bir azalma ve bazı aromatik yapıların atılması [103]. Bu sonuçlar çöp atığı ve atık arıtma çamuru karışımlarından elde edilen hümik asit numuneleri için rapor edilenlerle oldukça tatmin edicidir [104]. Takviye besin kaynağı olarak hümik asit içeren kültürlerde mikrobiyal kütle verimi oldukça artmış ve taze atıktan gelen hümik asit anlamında %195’e ulaşmıştır. Aynı zamanda, azalmış besin ve düşük enerji kaynağı şartlarında aynı hümik asit mikrobiyal biyokütle oluşumunu da engellemiştir. Bu etki hümik asitten ayrışmış ürünlerin inhibitör etkisine de atfedilmiştir. Oldukça kararlı hümik maddelerle meydana gelen düşük molekül ağırlıklı bileşiklerin polimerizasyonu hakkında hipotez geliştirilmiştir. Hümik maddelerin mikrobiyal ayrışım mekanizmasını izah eden birçok teşebbüs değişik derecelerdeki kömür ve bir fungi model sistemi kullanılarak yapılmıştır [82, 85, 87,114-117]. Bu veriler, Şekil 2’de gösterilen Basidiomycete ve Deuteromycete ile kömür hümik asitlerinin ayrışma şemasını çıkarmak açısından bu çalışmanın yazarlarına yol göstermiştir. Kömür ve türevi hümik asit üzerinde beyaz küf fungisinin etkileri fungal lignilotik enzim sistemlerinin özel durumları ile belirlenmiştir. Fungal lignilotik enzim sistemleri lignin peroksidaz, mangan peroksidaz, diğer peroksidaz, lakkaz ve H2O2 üreten enzimleri desteklemeyi içermektedir. Linyit hümik asitlerinin depolimerizasyonu sadece onun metilasyonundan sonra görülmüştür. Bu, katalize olmuş lignin peroksidaz gibi görülmektedir. Bu enzim ve enzim merkezli reaksiyonların baskın ürünler, monoaromatik bileşiklere metoksile edilmiştir. Mangan peroksidaz Mn(II) ile Mn(III) okside edilmiştir. Mn(III) Basidiomycete ile üretilen organik asitlerle (oksalat, malonat, malat, tartrat veya laktat) yapılan kompleksler sebebi ile kararlı hale getirilmiştir. Oluşturulan Mn(III) kompleksleri potansiyel yüksek redoks mediatörleri olarak hareket etmektedir. Mangan peroksidaz ve şelatlı Mn(III) tiyoller veya yağlar veyahut da doymamış yağ asitleri gibi uygun redoks mediatörlerinin ilavesi ile desteklenebilmektedir. Sonuç olarak, bu sistemin parçalama gücü enzimin tek başına yapacağından daha fazladır. Düşük molekül ağırlıklı fülvik asitlerin oluşumu hem Mn(II) ile in vivo ve hem de mangan peroksidaz kullanarak kömür hümik asitlerinin depolimerişzasyonunda in vitro çalışmalarında gözlenmiştir. Lakkaz ve kömür hümik asitlerinin in vitro olarak bozunması arasındaki korelasyon Trametes versicolor için de ayrıca gözlenmiştir [110]. Buna ilaveten, lakkaz sistemi ve farklı redoks mediatörleri başarılı biçimde son zamanlarda lignin ve kağıt hamuru depolimerizasyonuna uygulanmıştır [115]. Büyük organizmalarca karbon veya azot kaynağı olarak hümik maddelerin kullanım yolları oldukça karışıktır. Büyük bitkilerce hümik maddelerin alınması üzerine yapılan birçok çalışma gerçekleştirilmiştir. Hümik maddelerin bitkilerce alındığının ilk göstergesi bitki organlarındaki renk değişimlerinde olmaktadır [118].
Düşük molekül ağırlıklı fülvik asitlerin hümik asitlere nazaran daha yüksek derecede alınabildiği tespit edilmiştir. Bu en son yapılan çalışmada bu amaç için 14C-etiketli hümik maddeler kullanılmıştır [49]. Ayrıca, fülvik asitin bitki hücreleri tarafından alındığı ispatlanmıştır. Buna ilaveten, hümik özütünden elde edilen düşük molekül ağırlıklı bileşikler bitkilere daha kolay geçebilmektedirler. Özetle şu sonuçlara varılmıştır:
- Sınırlı karbon veya azot kaynaklarının olduğu ortamlarda mikroorganizmalarca hümik maddelerin kullanım seviyesi, yeterli düzeydeki besin ortamındakinden daha fazladır.
- Mikroorganizma biyokütlesi içersinde karbon dönüşüm verimliliği, hümik maddeler sadece karbon kaynağı olduklarında önemli oranda artmıştır. Fakat, bu etki düşük besin ve enerji kaynakları ortamında gözlenmemektedir.
- Hümik maddelerin mikrobiyal ayrışması, özel hücre metabolizmasına bağlı olarak enzimatik, enzimatik olmayan ve enzim başlangıçlı reaksiyonlar içermektedir.
- Hümik maddelerle uzun vadeli mikrobiyal reaksiyon, hem ayrışma işlemlerine ve hem de bu işlemlerin gelişimine engel teşkil eden yeni hümik benzeri maddelerin sentezine neden olmaktadır.
3.1.2. Hümik maddelerin hormon benzeri hareketi
Bitki gelişim hormonlarının hareketine benzeyen veya onları taklit eden kimyasal maddeler 1910’lardan zamanımıza kadar araştırılmaktadır. Bu hormonların ana sınıfları auksinler, gibberellinler ve sitokininlerdir. Onların çalışma şekli halen açıkça anlaşılmamıştır. Fakat, bitki gelişim düzenleyicilerinin doğrudan kopya, ter ve aktarım işlemlerini etkileyen hücrenin DNA’sı ve/veya RNA’sı üzerine hareket ettiğine inanılmaktadır [34]. Bitki gelişim düzenleyicilerinin değişik grupları arasındaki reaksiyonlar karmaşıktır ve birbirlerinin fonksiyonlarını tamamlayıcıdırlar. Bitki hormonları bitki veya toprak mikroorganizmaları tarafından, özellikle rizosferde (kök yüzeyi ve kökü çevreleyen bölgede) yerleşmiş olanları ile doğrudan üretilebilmektedir. Hümik maddelerin bitki ile hayvan kalıntılarının kimyasal ve biyolojik ayrışmasından ve mikroorganizmaların metabolik aktivitelerinden meydana gelmesinden dolayı onlar hormonsal karaktere sahip olabilmektedirler. Gerçekten de 1914’ten bu zamana kadar yapılan yayınlarda [27-31] hümik maddelerin auksin benzeri aktivite sergileyerek bitki gelişimini güçlendirdiği görülmüştür. Bottomley, 1917’de hümik maddelerin "auximones" ismi verilen maddeler içerdiğini söylemiştir [27]. Hillitzer de hümik maddelerin auksin olarak hareket ettiklerini iddia etmiştir [29]. Phuong ve Tichy hümik ve özellikle, fulvik asitlerin bazı auksin, gibberellin veya sitokinin benzeri aktivite gösterdiğini rapor etmiştir [119]. Fakat, uyarma etkileri gerçek bitki hormonlarıyla kıyaslandığında daha düşüktür. Bu durum otoriteleri hümik maddelerin fitohormon aktivite kaybı üzerinde bir neticeye getirmiştir. Cacco ve Dell’Agnola podzoldan (iğne yapraklı ormanlarla kaplı, soğuk, nemli bölgelerin karakteristik toprağı) “leaf disc senescence test” kullanarak hormon benzeri hareketlerini incelemiştir [33]. Hümik maddelerin aktivitesi de bilinen bitki hormonları (indole-3-acetic asit (IAA) veya N-6 benzyladenine) ile kıyaslandığında daha azdır. Hümik maddelerin auksin benzeri aktiviteleri üzerine elde edilen bulgular, yüksek hormonsal aktiviteye sahip bazı hümik fraksiyonlarını gösteren deneylerle desteklenmiştir [33, 35-37]. Özellikle, düşük molekül ağırlıklı fraksiyon morfolojik değişikliklere IAA ile neden olunanlara benzer şekilde sebebiyet vermiştir [66]. Bu fraksiyon IAA-oksidaz aktiviteyi arttırmıştır [121]. Daha sonraki çalışmalarda düşük molekül ağırlıklı hümik madde fraksiyonları IAA hücre zarı reseptörüne bağlandığı gösterilmiştir [122]. Fakat, hümik maddelerin hormon benzeri aktivitesinin bitki gelişim düzenleyicileri tarafından sağlandığına dair kimyasal bir delil halen söz konusu değildir. Hümik maddeler içindeki IAA konsantrasyonu %0.5 ila %3.7 (w/w) arasında değiştiği tahmin edilmektedir [123]. Bu durum, hümik maddelerin mikroorganizmalarca üretilen biyosentetik değişik aktif bileşikler içerdiğini göstermektedir. Örneğin, hümik madde yapısı bitki hormonları gibi işlem gören bitki gelişim düzenleyicisi poliaminler içerebilmektedir. Young ve Chen’in sonuçları göstermiştir ki hümik madde içindeki putrescinene, spemidine, ve spermine içeriği sırası ile 1.54-7.00, 0.39-3.88, 0.48-4.79 nM/g aralığındadır [38]. Otoriteler hümik maddelerin hormon benzeri aktivitesini poliaminlerin açıkladığı sonucuna varmıştır. Hümik maddelerin hormon benzeri aktivitelerinden sorumlu ana yapısal parçalarına dikkate alınmadığında hümik maddeler hormon benzeri maddelerin bir deposu ve onları bitkilerin hücrelerine nakledici olarak düşünülebilmektedir. Sonuç olarak, hümik maddelerin auksin benzeri aktivitesi sadece onların hücre zarı reseptörü ile reaksiyonuna atfedilmeyebilmektedir. Plazma zarı H+-ATPaz ve iz element elverişliliğini arttırma üzerindeki etkisi ayrıca düşünülmelidir. Toprak kök salgılarının özütleri hormonsal aktivite sergilemiştir [124]. Bu durum hümik maddelerin ayrışmasında ve hormon benzeri aktivitelerinin oluşmasında kök salgılarının önemli bir rolünü teyit etmektedir. Sonuçta, ikinci durum toprak-bitki etkileşiminin belirgin bir özelliği ile tespit edilmektedir. Buğdayda filizin ucunu saran koruyucu örtü (coleoptil) gelişimi üzerine kömür türevli hümik madde uygulaması ile uygulanan tüm konsantrasyonlarda yararlı etki sağlanmıştır [120]. Hümik asitin fraksiyonları himatomelanik hümik asit (CHM-GL02), kahverenkli ve gri hümik asit toplamı (CHR-GL02), kahverenkli fraksiyonlar (CHB-GL02) ve gri hümik asit (CHG-GL02) içinde ayrışmayı içermektedir. Hümik asitlerin değişik fraksiyonlarının auksin benzeri aktivitesi buğday tohumlarının coleoptilleri ile bioassay (bir maddenin biyolojik aktivetisinin veya mukavemetinin belirlenmesi) kullanılarak tahmin edilmiştir. Kısaca, buğday tohumları 72 saatte 25°C’da karanlıkta çimlendirilmiştir. Daha sonra, benzer uzunlukta (yaklaşık 5 mm) coleoptiller kesilmiş ve cam kapillari üzerine (bir kapillariye 3 adet coleoptil) yerleştirilmiştir. Coleoptillerin 5 mm’lik en üst kısmı öncelikle içten gelen auksinin etkisinden sakınmak için kaldırılmıştır. Daha sonra, coleoptillerin uzunlukları ölçülmüştür. Boncuk coleoptilleri ile dolu olan kapillariler Petri kabının içersine pH 6.0’da 5mM K-fosfat tamponu (şahit) veya fosfat tamponu içinde hümik asit çözeltisi ile yerleştirilmiştir. Daha sonra coleoptiller 72 saatte 25°C’da büyütülmüştür. Coleoptillerin boyu tekrar ölçülmüştür. Coleoptillerin boyundaki göreceli artış bir tepki olarak düşünülmüştür. Hümik asit konsantrasyonu 5 ila 100 mg/L arasında değişmiştir. Sonuçlar Şekil 3’de gösterilmiştir. Test edilen tüm hümik asit numuneleri coleoptillerin büyümesi üzerine tüm konsantrasyonlarda yararlı etki göstermiştir. Bu durum hümik asitlerin auksin benzeri aktivite yaptığını teyit etmektedir. Maksimum uyarma aktivitesi 10 mg/L’de gözlenmiş ve şahidin %156±9’una ulaşmıştır. Değişik hümik asit fraksiyonlarının verimliliği himatomelanik ve gri hümik asitler hariç aynı olmuştur. En yüksek etki, karboksilik (COO–) ve aromatik (CAr) gruplar olarak düşük içerikli kısımlarla ve en yüksek moleküler ağırlıkla karakterize edilen gri hümik asit için gözlenmiştir. Fakat, alkoksi (CAlkO) ile metoksi (CH3O) grupların en yüksek içeriklerine ve moleküler ağırlığın minimum değerine sahip olan himatomelanik hümik asitleri coleoptil gelişiminde en az yararlı etkiyi sergilemiştir. Hümik asit özellikleri ve onların auksin benzeri hareketi üzerine verilerin istatistiksel analizi, hümik asitlerdeki karboksilik grupların içeriği ve yararlı etki değeri (r = –0.96) arasındaki önemli bir negatif (P=%95) ilişkiyi ortaya koymuştur. Hümik asitlerin yüzey negatif yükünün ve hücre yüzeyinin doğal negatif yükünün oluşumunda karboksilik grupların belirleyici rolünü dikkate alarak bunun coleoptillerin yüzeyine hümik asitlerin emilişi olduğu ileri sürülmüştür. Bu durum ise hümik asitlerin auksin türü hareketini belirlemektedir.
Hümik maddelerin hormon benzeri hareketi üzerine veriler özetlenirse aşağıdaki sonuçlara varılabilmektedir:
- Hümik maddelerin hormon benzeri hareketinin seviyesi genellikle bitki hormonlarınkinden daha düşüktür.
- Hümik maddelerin hormon benzeri hareketinin mekanizması halen iyice anlaşılmamıştır ve ileri bir araştırmaya ihtiyaç vardır.
3.2. Besin Taşıyıcı Olarak Hümik Maddeler
Hümik maddelerin genellikle besin takviyesini arttırarak bitki gelişimini desteklediği düşünülmektedir [52, 55, 135, 136]. Fakat, bazı veriler hümik maddelerin bulunduğu ortamlarda biyokütle veriminde önemli artış olmadığını göstermiştir [58, 70]. Sınırlı besin kaynağı şartlarında hümik maddelerin verilmesi çok zikredilen bir durum olduğundan bu farklılık, optimum şartların üstünde bir ortam kullanılarak sağlanılmıştır [97]. Örneğin, demir klorozu (bitkilerdeki demir eksikliği) hümik madde uygulaması ile düzeltilebilmektedir. Bu durum, bitkilerin demir isteğinde yararlı bir rol oynamaktadır [61, 137- 139]. Hümik maddelerin bu yararlı etkisi onların şelatlama kabiliyetine atfedilmiştir. Hümik maddeler demiri kolayca alabilecekleri formda sağlamaktadır [140]. Hümik maddelerin varlığı da bitkilerce demir alımını iyon naklinde hümik maddelerin katılımı [141] ve H+-enzim uyarılması sonucu kolaylaştırmaktadır [142, 143]. Hümik asitler hem karboksilik ve fenolik gruplar gibi hidrofilik etki alanları hem de alkilik ve aromatik kısımları içeren yüzey aktif maddesi benzeri bir yapıya sahiptir. Bu amfifilik karakteri sebebi ile hümik maddeler doğal yüzey aktif maddeleri gibi davranmakta ve biyolojik zarlar da içeren değişik doğal yüzeylerde emme yapabilmektedir [125-132]. Biyolojik yüzeyler üzerindeki hümik maddelerin emilişi, çözeltiden çözünmüş karbonun kaybı ile doğrudan [125] ve hümik maddelerin varlığında veya yokluğunda bireysel hücrelerin elektroforezi (eriyik içinde dağılmış iyonların elektrik akımı etkisiyle, pozitif veya negatif kutba doğru hareketi) takip eden değişikliklerle dolaylı olarak [126] gösterilmiştir. Çalışan biyolojik yüzeyler fitoplaktonu [125-128], izole edilmiş balık solungaç hücrelerini [128], bakterileri [129, 130], fungileri [131] ve bitkileri [132] kapsamaktadır. Bunların çeşitliliği biyolojik zarlar üzerinde hümik maddelerinin emilişinin genel bir işlem olduğunu göstermektedir. Yüzey aktif özellikleri sebebi ile hümik maddeler zarın yapı ve akışkanlığını ile hücre zar geçirgenliğini etkileyebilmektedir [133]. Zar geçirgenliğindeki artış, canlıların besinleri almasında da bir artışa neden olmaktadır [129, 132]. Ermakov ve ark. potasyum humatın bitki hücresine yapıştığını ve hücre protoplazmasındaki reaksiyonlar vasıtası ile dolaylı olarak onların uzanabilirliliğinin arttığını bulmuştur [134]. Hücre duvarlarının gittikçe kalınlaştığı hümik asitlerde ve hücre duvarı polimerlerinde bulunan fenolik grupların peroksidaz ikizleşmesi ile uyarılarak bulunmuştur. Bizim çalışmalarımız kireçli toprak şartlarında demiri kullanan domates ve buğday bitkilerinin demir eksikliği kapasitesi üzerine hümik maddelerin yararlı etkilerini de ortaya çıkarmıştır. Standart alkali ekstraksiyon [144] ve katyon değişim reçinesi kullanarak turbadan ayrıştırılan hümik maddeler değişebilir demiri almak için hazırlanmıştır. Domates ve buğday tohumları saf su ile nemlendirilmiş filtre kağıdı üzerinde çimlendirilmiştir. Domates için 10 gün ve buğday için 5 gün bekledikten sonra, çimler plastik kaplara aktarılmıştır. Bu kaplar hem demir bulunan hem de demir olmayan havalı Hoagland besin çözeltisi içermektedir. Bitkilerin büyümesi için 40 gün daha beklenmiştir. Demir, FeSO4 olarak 24 μM konsantrasyonunda sağlanmıştır. FeSO4 hem hümik madde formunda hem de Fe-DTPA (demir- dietilen triamin pentaasetik kompleksi) formundadır. Kireçli toprakları uyarmak için besin çözeltisinin pH’ı CaCO3 kullanarak 8’e ayarlanmıştır. Bitki büyüdükten 20 gün sonra elektron taşıma hızı (ETR) manasında fotosentez verimi ve etkili kuantum verimi, pulse amplitude modulation (PAM) fluorometer (PAM-2000, Walz, Germany) kullanılarak tahmin edilmiştir. Bitkiler 40 gün sonra hasat edilmiş ve uzunluk, ağırlık ve klorofil içeriği ölçümleri yapılmıştır. Veriler Tablo 3’de gösterilmiştir. Demirsiz besin çözeltisi içinde yetişen hem domates ve hem de buğday demir eksikliğinin görsel belirtilerini (yaprak klorozu) sergilemişlerdir. Klorofil a/b oranı stres altında bitkilerin ışık toplama kapasitesinin bir göstergesi [145] olarak kullanılmaktadır. Bu oran şahit olarak kullanılan domates için 0.59 ve şahit buğday için 0.29’dur. Sonuç olarak şahit bitkilerin biyometrik parametreleri (uzunluk ve ağırlık gibi) esaslı biçimde iyice bastırılmıştır.
Tablo 3’den de görüldüğü üzere, inorganik demir (FeSO4) ilavesi tek başına bitkilerin demir ihtiyacını karşılamamaktadır: ağırlık, uzunluk, fotosentez verimi ve klorofil içeriği şahit bitkilerinki ile aynıdır. Besin ortamının alkali şartları (pH 8) nedeni ile bitkilerin demir almasını elverişsiz hale getiren çözünmeyen Fe(III) hidroksit oluşması durumu beklenmektedir. Aynı zamanda, hümik madde ve FeSO4 ilavesi bitkilerin ağırlık, uzunluk, fotosentez verimi ve klorofil içeriğinde ciddi bir artış sağlamıştır. Fotosentetik parametreleri (ETR ve verim) Fe-DTPA uygulanan bitkiler için belirlenen değerlere dengeli biçimde ulaşılmıştır. Oysaki ağırlık, uzunluk ve klorofil içeriği Fe-DTPA uygulanan bitkilerdekinden halen daha azdır. Sentetik demir şelatı Fe-DTPA ilavesi ile yetişen bitkiler klorozun herhangi bir belirtisini göstermemişlerdir. Bunun yanında uzunluk ve biyokütle olarak da en yüksek değerlerle karakterize edilmişlerdir. Sadece hümik madde ilavesi demir eksikliği olan bitkilerin kısmi bertarafına neden olduğu ilginç tespitlerdendir. Özellikle fotosentez verimi ve klorofil içeriği humus uygulanan bitkilerde önemli oranda artmıştır. Ektraksiyon prosedürü boyunca değişebilen demir kaldırılması anlamı, bitkilerin hümik maddelerin demir içeriğini kullanmayı sevdiğini göstermektedir. Sonuç olarak, besin kaynağının arttırılmasının etkisi besin kaynağı olarak hümik maddelerin bir işlevini kaplamaktadır. Diğer bir açıklama ise hümik maddelerin fotosentez üzerine doğrudan etkisidir. Bununla alakalı veri literatürde rapor edilmiştir [65, 67]. Bu rapora göre, hümik maddelerin kuinoid yapıları elektron transferini sağladığından sonuçta fotosentez verimini arttırdığı ileri sürülmüştür. Genelde elde edilen sonuçlar, hümik maddelerle bitkilerin demir eksikliğinin bertarafının yanı sıra demir alımının artışının bir sonucu olarak bitki biyokütlesini çoğalttığını teyit etmiştir. Gözlenen bu etkiler Zn ve Mn gibi diğer iz elementler için de tespit edilebilmektedir. Özetlenirse:
- Hümik maddeler besin sağlamada yararlı etkiler göstermektedir.
- Bitki beslemede hümik maddelerin en çok ifade edilen yararlı etkileri elverişsiz yetişme şartlarında gözlenmiştir.
- Sınırlı besleme şartlarında hümik maddelerin varlığı bitkilerin kısmi olarak kurtulmasına neden olmaktadır.
3.3. Biyokimyasal Reaksiyonların Katalistleri Olarak Hümik Maddeler
Hümik maddelerin biyokimyasal reaksiyonlara doğrudan katılması sadece birkaç durumda gözlenmiştir [26, 116]. Fakat, hümik maddeler biyokimyasal reaksiyonları dolaylı, nominal olarak hümik madde-enzim kompleksleri oluşturmasıyla veya enzimatik reaksiyona besin maddesi olarak katılmasıyla etkileyebilmektedir. Hümik madde-enzim sistemlerinde oluşan başlıca işlemler Şekil 4’de şematik olarak gösterilmiştir. Mikroorganizmalar ve bitkiler toprak enzimlerinin ana kaynağıdırlar [146]. Bitkiler çözünebilir fazda ve katı fazda ayrıştırılmalıdır. Ekstrasellüler (hücre dışı) toprak enzimlerinin organik veya inorganik koloitlerle, özellikle hümik maddelerle birleştirilebildiği iyi bilinmektedir. Üreaz, proteaz, fosfataz, hidrolaz, lakkaz ve peroksidaz gibi gerekli toprak enzimleri hümik maddelerle kompleksleri olarak toprak özütlerinde incelenmiştir [26, 147]. İnvertaz (sakarozun bağırsaklarında emilimini sağlayan bir enzim) ile ksilanaz [148, 149], fosfataz [150] ve üreaz [151] enzimleri için gösterildiği üzere organa-mineral partiküllerin yüzeyindeki enzimlerin dağılımı kuvvetli biçimde partikül boyutuna bağlıdır. Buna ilaveten, değişik mineral veya organo-mineral yüzeyler, asit fosfataza kurulduğu gibi enzim aktivitesi üzerinde inhibitör etkisine sahiptirler [150]. Yukarıdaki veri göstermiştir ki hümik maddeler, enzim sabitlemeyi ve onların uzun vadede kararlılığını geliştirmeyi kolaylaştıran enzim taşıyıcı rolünü oynayabilmektedir. Hümik madde yapısındaki karboksil, karbonil, hidroksil ve amid gruplarının varlığı nedeni ile [1, 2], onlar hareketsiz sabit enzimler için destek kurabilmektedirler. İnvertaz toprak hümik maddeleri ile aktivite edildiğinde aminopropil silika üzerinde sabitlenmiştir. Sabitleştirme tekniği sabit enzimlerin miktarının artması ve aktivitelerinin güçlenmesi bakımından verimini arttırmıştır [152]. Toprak reaksiyonları bağlamında hümik madde-ekstrasellüler enzim komplekslerinin oluşma mekanizması, inorganik partikül-hümik madde-enzim komplekslerinin bir oluşumunu izleyen hümik maddelerle inorganik maddelerin aktivasyonunu içerebilmektedir. Sonuç olarak, topraktan bu komplekslerin özütlenmesine kadar inorganik partiküllerin ayrışması oluşmakta ve sadece hümik madde-enzim kompleksleri elde edilmektedir. Proteaz-hümik madde komplekslerini yorumlarken onların oluşmasının hem proteazın tipi ile bileşiğine hem de hümik maddelerin yapısına bağlı olduğu not düşülmelidir. N-benzoilkarbonil-L-fenilalaninil-L-leucine–hidrolize proteaz daha az yoğun hümik maddelerle birleştirilirken N-benzoil-L-argininamidi hidrolize etme kabiliyetine sahip proteaz fazla yoğunlaşmış hümik maddelerle bitleştirilebildiği gösterilmiştir. Kazein-hidrolize proteazları genellikle humusa çevrilemeyen organik madde ile birleştirilmektedir [153]. Üreaz-hümik madde kompleksleri üzerine yapılan çalışmalar da bu verilerle ilişkilidir [154]. Üreaz aktivitesi ve kararlılığı üzerine iki farklı hümik asit fraksiyonunun etkileri (yüksek molekül ağırlığı, 100-300 kDa ve düşük molekül ağırlığı, 10-20 kDa) değerlendirilmiştir. Yüksek molekül ağırlıklı hümik asit fraksiyonu üreaz aktivitesini önemli oranda pH 6’da engellemiştir. Fakat, pH 7 ve 8’de üreaz aktivitesine herhangi bir etkisi olmamıştır.
Yüksek molekül ağırlıklı hümik asit fraksiyonu üreaz aktivitesini 11 günlük bir süreçte proteaz ve Cu2+ / Hg2+ (çözünebilir üreaz aktivitesinin iki güçlü inhibitörü) ile kararlı hale getirmiştir. Fakat, düşük molekül ağırlıklı hümik asit fraksiyonları ise pH 6, 7 ve 8’de üreaz aktivitesini engellemiş ve proteaz varlığında da kararlı hale getirememiştir. Bu sonuçlar iki hümik asit fraksiyonunun farklı olarak hem üreaz aktivitesini ve hem de kararlılığını etkilediğini göstermektedir. Düşük ve yüksek molekül ağırlıklı hümik asit fraksiyonları ile üreazın engellenmesi esasen iki ağır metalin varlığından kaynaklandığı ileri sürülmüştür. Bu iki ağır metal, hümik asit üzerinde sabit olmasına rağmen üreazla halen etkileşme kabiliyetindedirler. Bu sonuç, [52, 122, 137, 154] makalelerinde rapor edilen düşük ve yüksek molekül ağırlıklı hümik asit fraksiyonlarının değişik etkilerinin hümik maddelerin kompleks tabiatıyla da alakalı olması nedeni ile çok basit olduğu görülmektedir. Hümik maddelerin enzimlerle doğrudan etkileşimi topraktaki çözünür enzimlerin yaygın biçimde meydana gelmesinden olduğu farz edilmektedir. Çözünür fazda bulunan toprak enzimleri ile hümik maddelerin muhtemel modifikasyonu, hem doğal ve hem de sentetik hümik maddelerle oksidoreduktazın doğrudan etkilenmesi üzerine odaklanan Şekil 3’de özetlenmiştir. Mn-peroksidaz ile kömür hümik asitlerinin depolimerizasyonunun fülvik asit ve karbon dioksit oluşumuna neden olduğu belirtilmiştir [87]. Sentetik olarak 3-fluorocatechol’dan türetilen hümik asitler de herhangi bir moleküler ağırlık kaybetmeksizin Mn-peroksidaz ile modifiye edilmiştir [155]. Bu durum sentetik hümik asitlerin küçük molekül ağırlığına atfedilmiştir. Fakat, peroksidazın ve lakkazın hümik maddeleri polimerize ettiği tespit edilmiştir [116, 156, 157]. Karaturp peroksidazı ile katalize edilen linyit hümik asitlerinin oksidasyonunun hümik asitlerin molekül boyutunda zamanla bir geliştirme göstererek molekül ağırlığında bir artışa neden olduğu ifade edilmiştir. Polimerizasyon pH’a bağlıdır. pH 4.7’den ziyade pH 7.0’de daha ileri derecede gerçekleşmektedir. Hümik asit-enzim reaksiyonlarının mekanizması aril ve alkil eterlerinin oluşmasını da içermektedir. Volkanik topraktan, okside kömürden ve leonarditten elde edilen hümik asitlerin peroksidaz ve hidrojen peroksit ortamında benzer değişimler gösterdiği ileri sürülmüştür [116]. Elemental analiz, size-exclusion kromatografi, IR ve 13C-NMR spektroskopi verilerine göre toprak hümik asitlerine benzer yüksek molekül ağırlıklı bileşiklerin oluşumuna lakkazla hümik benzeri maddelerin doğrudan sentezi neden olmuştur [157]. Hümik madde fraksiyonlarının enzimler ve onların biyosentezi üzerine doğrudan etkisi üzerinde bitki malzemeleri kullanılarak çalışılmıştır [50, 52, 141, 142]. Mısırın protein sentezi üzerine hümik maddelerin düşük molekül ağırlıklı fraksiyonlarının kurulmuş ileri kopya etkisine rağmen bu etkinin mekanizması açık değildir [52]. Enzimlerde hümik maddelerin doğrudan etkisi üzerine yapılan deneyler mikrosomal (protoplazmanın küçük granülü) kullanılarak yürütülmüştür [50, 141,142]. Düşük ve yüksek molekül ağırlıklı fraksiyonların K+-stimule ATPaz aktivitesini uyardığı tespit edilmiştir. Bu sonuçların tasdiki düşük molekül ağırlıklı fraksiyonla izole edilmiş plazma zarlarının H+-ATPaz aktivitesini uyarmasıdır. Basidiomycetes Coriolus hirsutus gelişimi boyunca hümik maddelerin lakkaz biyosentezinin başlatılması güzelce ifade edilmiştir [157]. Fakat, bu başlatma mekanizması daha henüz çalışılmamıştır. Özetlenirse; - Enzimler ve hümik maddeler arasındaki doğrudan etkileşim çok az çalışılmıştır.
- Oksidoredüktazlarla etkileşiminin bir sonucu olarak hümik maddelerin polimerizasyon/depolimerizasyon dönüşümleri kurulmuştur.
3.4. Hümik Maddelerin Anti-Oksidant Aktivitesi
Serbest radikaller içeren reaktif oksijen türlerine karşı biyolojik makromoleküllerin, dokuların ve hücrelerin korunması canlılar için çok büyük öneme haizdir. Oksidatif stres, biyolojik sistemlerin toplam anti-oksidantındaki azalmanın bir neticesi olarak oksidantlara fazlaca maruz kalmaktan kaynaklanmaktadır. Biyolojik sistemlerin korunmasındaki temel rol anti-oksidantlar denen özel bileşiklerce oynanmaktadır. Bu grupların genel tanımı onların anti-oksidant hareket kabiliyeti kavramında uç (radikal)-zincir oksidasyon işlemlerini kırmak için veya serbest radikallerin miktarını azaltmak için verilmektedir. Hümik maddelerin anti-oksidant aktivite çalışmasına büyük ilgi duyulmaktadır. Fakat, hümik maddelerin anti-oksidant aktivitesinin ölçümü bir takım metodolojik zorluklara neden olmaktadır. Mesela, serbest radikaller oluşturan sistem bileşenleriyle hümik maddelerin etkileşimi ve hümik madde yapısının karmaşıklığı örnek verilebilir. Voltametre kullanarak hümik maddelerin anti-oksidant aktivitesini ölçme teşebbüsü [158]’de tarif edilmiştir. Otoriteler oksijen süperoksit radikalinin elektrokimyasal üretim metodunu kullanmışlardır. Bitkilerinki ve hümik maddelerinki gibi bazı standart anti-oksidantların (C vitamini, glikoz, resorkinol ve kateşol) anti-oksidant aktivitesini ölçmüşlerdir. Verilerin yorumlanmasındaki temel problemler hümik maddelerin özellikleri verilmemesi ve anti-oksidant aktivitenin standart birimlerinin korelasyonun sağlanmamasıdır. Fakat, standart anti-oksidantlar numuneler ve bitki merkezli numuneler arasında hümik maddeler fitalosianin Co, fitalosianin Ni ve fitalosianin Cr ile kıyaslandığında en yüksek anti-oksidant aktivite değerini göstermiştir. Elde edilen veriler oksijen süperoksit radikalinin dioksijene değişiminde etkileşim mekanizmasını ileri sürme fikrini vermiştir.
Sonuç olarak, hümik maddeler radikal reaksiyonları keserek ve biyolojik makromoleküller ile hücre zarlarının zarar görmesini engelleyerek ekosistemde koruyucu bir fonksiyon görebilmektedir.
Hümik maddelerin anti-oksidant aktivitesine gösterilen temel ilgiye merak uyandırılmasının sebebi; kuraklık, ısı, herbisit kullanımı ve ültraviyole radyasyonu gibi olaylar türünden serbest radikallerin (OH●, O2H●, ROO2●) oluşumuna neden olan faktörleri de yok eden çevredeki rolleridir.
Hümik maddelerin yapısı ve moleküler ozon (O3) ile hidroksil radikallerine (OH●) karşı reaktifliği arasında ilişki kurulmuştur [159-161]. Hümik maddelerin yapısındaki C=C bağlarının miktarı ve konsantrasyonlarına karşılık oksijen temizleme aktivitesinin pozitif korelasyonları O3● ve OH● ile yaptığı radikal reaksiyonlarda gözlenmiştir. Ozon tüketimi ve OH● temizleme hızı sabitleri aromatik karbon içeriği ile olumlu, fakat, alifatik karbonla da olumsuz bağ kurarak bulunmuştur. Elde edilen verilere [159] göre, ozonun tercihen hümik maddelerin aromatik içerikleri ile, özellikle, elektronla zenginleştirilmiş aromatiklerle reaksiyona girdiği sonucuna varılmıştır. Bu bulgulara göre, oksidasyon hızı parametreleri ve C/H oranı (yapının doymamışlık derecesinin göstergesi) arasında istatistikî olarak önemli ilişki bulunmuştur. Böylece, hümik maddelerin kimyasal doğası ozonla reaksiyonları üzerine güçlü bir kontrol çıkarmaktadır.
Hümik madde varlığında atrazinin ozonlaşmasını katalize eden MnO çalışması; atrazinin oksidasyon verimini azaltan ozonlaşması süresince 2-6 mg/L (DOC) konsantrasyonundaki hümik maddelerin hidroksil radikallerini temizlediğini ortaya koymuştur. Fakat, hümik maddeler düşük konsantrasyonlarda (1 mg/L DOC) oldukları zaman hem mangan türleri ve hem de hümik maddeler, atrazinin yok edilmesini destekleyen hidroksil radikallerinin oluşumunu başlatıp yürütmektedirler. Özetle;
- Hümik maddelerin yüksek konsantrasyonlarında radikal temizleme etkileri gözlenmektedir.
- Hümik maddelerin anti-oksidant aktivitesi güçlü olarak onların doymamış kısımlarının zenginleştirilmesi gibi yapısal özelliklerine bağlıdır.
4. Sonuç
Hümik maddelerin yavaşlatıcı, hafifletici, azaltıcı aktivitesi üzerine elde edilen verileri yorumlarken aşağıdaki başlıca aksiyon özellikleri ortaya çıkartılmıştır:
- Organizma gelişimi üzerine etkisi
- Besin takviyesini güçlendirmesi
- Hümik maddelerin enzimler ve biyokimyasal reaksiyonların katalizleri ile etkileşimleri
- Anti-oksidant aktivitesi
Hümik madde yapısının kompleksliği gözlenen biyolojik etkilere geniş alanda bir değişiklik sağlamaktadır. Bu durum, hümik maddelerin ksenbiyotiklerle, besin maddeleri ile, enzimlerle, zarlarla etkileşimi için doğrudur. Sonuçta, hümik maddelerin biyolojik sistemin parçaları ile girdiği muhtemel etkileşimi ve onların yapısal kompleksliliği bir kenara bırakılırsa biyolojik etkileri üzerine yapılan çalışmalar verilerde ve yorumlamalarında kafa karışıklığına neden olabilmektedir. Bu problemin üstesinden gelmek için deneysel tasarım yapılmalı ve hümik maddelerin bilinen preperatları kullanılmalıdır. Hümik maddelerle ortaya çıkartılan diğer özel biyolojik aktivite ise canlılarda ve ekosistemde en çok ifade edilen etkilerinin hem özel hem de özel olmayan stres faktörleri ile teşvik edilen stres altında gözlenmesidir. Sonuç olarak, hümik maddeler stres faktörlerinin ters etkilerini azaltan çevresel ayarlayıcılar olarak düşünülmektedir.
6. Referanslar
1. Thurman, E. M. (1985) Organic geochemistry of natural waters, Martinus Nijhof/Dr. W. Junk Publishers, Dordrecht.
2. Orlov, D. S. (1990) Soil humic acids and general theory of humification, Moscow State University Publisher, Moscow.
3. Clapp, C.E., Hayes, M.H.B. and Swift, R.S. (1993) Isolation, fractionation, functionalities, and concepts of structure of soil organic macromolecules, in A J. Beck, K.C. Jones, M.B.H. Hayes, and U. Mingelgrin (eds.), Organic substances in soil and water, Royal Society of Chemistry, Cambridge.
4. Aiken, G.R., McKnight, D.M. and MacCarthy, P. (1985) Humic substances in soil, sediment, and water, Wiley, New York.
5. Senesi, N. (1993) Organic pollutant migration in soils as affected by soil organic matter. Molecular and Mechanistic Aspects, In D. Petruzzelli and F.G. Helfferich (eds), Migration and fate of pollutants in soils and subsoils, NATO ASI Series, Vol. G 32, Springer- Verlag, Berlin, p. 47.
6. Landrum, P.F., Reinhold, M.D., Nihart, S.R. and Eadie, B.J. (1985) Predicting the bioavailability of organic xenobiotics to Pontoporeia Hoyi in the presence of humic materials and natural dissolved organic matter, Environ. Toxicol. Chem. 4, 459-467.
7. McCarthy, J.F. and Jimenez, B.D. (1985) Reduction in bioavailability to bluegills of polycyclic aromatic hydrocarbons bound to dissolved humic material, Environ. Toxicol. Chem. 4, 511-521.
8. Oris, J.T., Hall, A.T. and Tylka, J.D. (1990) Humic acids reduce the photo-induced toxicity of anthracene to fish and daphnia, Environ. Toxicol. Chem. 9, 575-583.
9. Day, K.E. (1991) Effects of dissolved organic carbon on accumulation and acute toxicity of fenvalerate, deltamethrin and cyhalothrin to Daphnia Magna (Straus), Environ. Toxicol. Chem. 10, 91-101.
10. Perminova, I.V., Kovalevsky, D.V., Yashchenko, N.Yu., Danchenko, N.N., Kudryavtsev, A.V., Zhilin, D.M., Petrosyan, V.S., Kulikova, N.A., Philippova, O.I., and Lebedeva, G.F. (1996) Humic substances as natural detoxicants, in C.E. Clapp, M.H.B. Hayes, N. Senesi, and S.M. Griffith (eds.), Humic substances and organic matter in soil and water environments: characterization, transformations and interactions, St. Paul, MN, USA, pp. 399-406.
11. Perminova, I.V., Grechishcheva, N.Yu., Kovalevskii, D.V., Kudryavtsev, A.V., Petrosyan, V.S. and Matorin, D.N. (2001) Quantification and prediction of detoxifying properties of humic substances to polycyclic aromatic hydrocarbons related to chemical binding, Environ. Sci. Technol. 35, 3841-3848.
12. Misra, V., Pandey, S.D. and Viswanathan, P.N. (2000) Effect of humic acid on the bioavailability of γ-hexachlorocyclohexane in Marsilea minuta (L.), Environ. Monitor. Assessment 61, 229-235.
13. Khristeva, L.A. (1953) The participation of humic acids and other organic substances in the nutrition of higher plants, Pochvovedenie 10, 46-59.
14. Khristeva, L.A. (1970) Theory of humic fertilizers and their practical use in the Ukraine, in Robertson R.A. (ed.), 2-nd International Peat Congress, Leningrad, HMSO, Edinburgh, 543-558.
15. Gorovaya, A.I., Orlov, D.S. and Shcherbenko, O.V. (1995) Humic substances: structure, functions,mode of action, protective properties, role in the environment, Naukova dumka, Kiev.
16. MacCarthy, P. and Rice, J.A.(1988) in Proceedings of Chapman Conference on the Gaia Hypothesis, San Diego, CA, March,7-11.
17. Sawada, A., Tanaka, S., Fukushima, M. and Tatsumi, K. (2003) Electrokinetic remediation of clayey soils containing copper(II)-oxinate using humic acid as a surfactant, J. Hazard. Mater. B96, 145-154.
18. Fukushima, M. and Tatsumi, K. (2001) Functionalities of humic acid for the remedial processes of organic pollutants, Analyt. Sci. 17, i821-i823.
19. Lesage, S., Novakowski, K.S., Brown, S. and Millar, K. (2001) Humic acids enhanced removal of aromatic hydrocarbons from contaminated aquifers: developing a sustainable technology, J. Environ.Sci. Health A 36(8), 1515-1533.
20. Molson, J.W., Frind, E.O., Van Stempvoort, D.R. and Lesage, S. (2001) Humic acid enhanced remediation of an emplaced diesel source in groundwater - 2. Numerical model development and application, J. Contam. Hydrol. 54, 277-305.
21. Schwartz, D.L. (1999) Coal-derived humic acid for removal of metals and organic contaminants, Solid waste and emergency response (5102G), EPA 542-N-99-002. 31, 1.
22. Sanjay, H.G., Srivastava, K.C., Walia, D. S. (1997) Mixed waste remediation using HUMASORB-CSTM– an adsorbent to remove organic and inorganic contaminants, ARCTECH Inc., Chantilly, Virginia.
23. Gamble, D.S, Khan, S.U. (1988) Atrazine hydrolysis in aqueous suspension of humic acid at 25.0°C, Can. J. Chem. 66, 2605-2617.
24. Zeng, K., Hwang, H.-M., Yu, H. (2002) Effect of dissolved humic substances on the photochemical
degradation rate of 1-aminopyrene and atrazine, Int. J. Mol. Sci. 3, 1048-1057.
25. Klavins, M., Dipane, J., Babre, K. (2001) Humic substances as catalysts in condensation reactions, Chemosphere 44, 737-742.
26. Masciandaro, G. and Ceccanti, B. (1999) Assessing soil quality in different agro-ecosystems through biochemical and chemico-structural properties of humic substances, Soil Tillage Res. 51, 129-137.
27. Bottomley, W.B. (1914) Some accessory factors in plant growth and nutrition, Proc. of the Royal Society of London (Biology) 88, 237-247.
28. Bottomley, W.B. (1914) The significance of certain food substances fro plant growth, Annals of Botany(London) 34, 353-365.
29. Hillitzer, A. (1932) Uber den einfluss der humusstoffe auf das wurzelwachstum, Beihefte zum Botanischen Zentralblatt 49, 467-480.
30. Paszewski, A., Trojanowski, J. and Lobarzewska, W. (1957) Influence of the humus fraction on the growth of oat coleoptiles, Annales Universitatis Marie Curie Sklodowska, Sklodowska 12, 1-13.
31. O’Donnel, R.W. (1973) The auxin-like activity of humic preparations from leonardite, Soil Sci. 116, 106-112.
32. Azam, F. and Malik, K.A. (1982) Effect of humic acids on seedling growth of wheat (Triticum aestivum L.) under different conditions, Pak. J. Botany 14, 47-48.
33. Cacco, G. and Dell’Agnola, G. (1984) Plant growth regulator activity of soluble humic complex, Can.J. Soil Sci. 62, 306-310.
34. Syltie, P.W. (1985) Effects of very small amaounts of highly active biological substances on plants growth, Biol. Agricult. Horticult. 2, 245-269.
35. Dell’Agnola, G. and Nardi, S. (1987) Hormone-like effect of enhanced nitrate uptake induced by depolycondenced humic fractions obtained from Allobophora rosea and A. caliginosa faeces, Biol.Fertil. Soils 4, 115-118.
36. Nardi, S., Arnoldi, G. and Dell’Agnola, G. (1988) Release of hormone-like activities from Allobophorarosea and A. caliginosa faeces, Can. J. Soil Sci. 68, 563-567.
37. Piccolo, A., Nardi, S. and Concheri, G. (1992) Structural characteristics of humus and biological activities, Soil Biol. Biochem. 24, 273-380.
38. Young, C.C. and Chen, Y. (1997) Polyamines in humic acid and their effect on radical growth of lettuce seedlings, Plant Soil 195, 143-149.
39. Niklewski, B. and Wojciechowski, J. (1937) Uber den Einfluss der wasserloeslichen Humusstoffe auf die Entwicklung einiger Kulturpflanzen, Biochem. Z. 271, 11-122.
40. Rauthan, B.S. and Schnitzer, M. (1981) Effects of a soil fulvic acid on the growth and nutrient content of cucumber (Cucumis sativus) plants, Plant Soil 63, 491-495.
41. Iswaran, V., Sen, A. and Vimal, O.P. (1973) Influence of humus spray on the yield of soybean Glycine max var, Clark. Sci. Cult. 39, 143-144.
42. Mishra, B. and Srivastava, L.L. (1988) Physiological properties of humic acids isolated from some major soil accosiation of Bihar, J. Ind. Soc. Soil Sci. 36, 83-89.
43. Solaiappan, U., Muthusankaranarayanan, A. and Muthusamy, P. (1995) Effect of humic acid on rainfed upland cotton (Gossypium hirsitum), Ind. Agron. 40, 156-157.
44. Loffredo, E., Senesi, N. and D’Orazio, V. (1997) Effect of humic acids and herbicides, and their combinations on the growth of tomato seedlings in hydroponics, Z. Pflanzenernaehr. Bodenk. 160, 455-461.
45. Sathiyabama, K. and Selvakumari, G. (2001) Effect of humic acid on growth, yield and nutrition of Amaranthus, South Ind. Horticult. 49(Special): 155-156.
46. Zachariakis, M., Tzorakakis, E., Kritsotakis, I., Siminis, C.I. and Manios, V. (2001) Humic substances stimulate plant growth and nutrient accumulation in grapevine rootstocks, Acta Horticult. (ISHS) 549, 131-136.
47. Prozorowskaya, A.A. (1936) The effect of humic acid and its derivatives on the uptake of nitrogen, phosphorus, potassium and iron by plants, in Organo-mineral fertilizers, collected papers of Research Scientific Institute for Fertilizers, Insecticides, and Fungicides, p. 127 (in Russian).
48. Saalbach E. (1956) Einfluss von Huminstoffe auf den Stoffwechsel der Pflanzen, in Rapp. D. (ed), Trans. 6 International Congr. Soil Science, pp. 107-111.
49. Vaughan, D., Malcom, R.E. and Ord, B.G. (1985) Influence of humic substances on biochemical processes in plants, in D. Vaughan and R.E. Malcom (eds.), Soil organic matter and biological activity, Martinus Nijhoff/Junk W Publishers, Dordrecht, pp. 77-108.
50. Nardi, S., Concheri, G., Dell’Agnola, G. and Scrimin, P. (1991) Nitrate uptake and ATPase activity in oat seedlings in the presence of two humic fractions, Soil Biol. Biochem. 26, 1341-1346.
51. Pinton, R., Cesco, S., Iacolettig, G., Astolfi, S. and Varanini, Z. (1999) Modulation of NO3– uptake by water extractable humic substances: involvement of root plasma membrane H+-ATPase, Plant Soil 215, 155-161.
52. Nardi, S., Gessa, C., Ferrarese, L., Trainotti, L., Casadoro, G., and Pizzeghello, D. (2000) A low molecular weight humic fraction on nitrate uptake and protein synthesis in maize seedlings, Soil Biol.Biochem. 32, 415-419.
53. Cacco, G., Attina, E., Gelsomino, A. and Sidari, M. (2000) Effect of nitrate and humic substances of different molecular size on kinetic parameters of nitrate uptake in wheat seedlings, J. Plant Nutr. Soil Sci. 163, 313-320.
54. Ram, N. and Verloo, M. (1983) Effect of natural complexants on the uptake of trace elements by barley and their extractable amounts in soil, Agrochimica 28, 13-19.
55. Fortun, C., Rapsch, S. and Ascaso, C. (1985) Action of humic acid preparations on leaf development, mineral elements contents and chloroplast ultrastructure of ryegrass plants, Photosynthetica 19, 294-299.
56. Vaughan, D. and Malcom, R.E. (1985) Influence of humic substances on growth and physiological processes, in D. Vaughan and R.E. Malcom (eds.), Soil organic matter and biological activity,Martinus Nijhoff/Junk W Publishers, Dordrecht, pp. 37-76.
57. Chen, Y. and Avaid, T. (1990) Effect of humic substances on plant growth, in P. MacCarthy, C.E. Clapp, R.L. Malcom, and P.R. Bloom (eds.), Humic substances in soils and crop science: selected readings, Soil Sci. Soc. Am., Madison, pp.161-186.
58. Mackowiak, C.L., Grossl, P.R. and Bugbee, B.G. (2001) Beneficial effects of humic acid on micronutrient availability to wheat, Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 1744-1750.
59. Varanini, Z. and Pinton, R. (2001) Direct versus indirect effects of soil humic substances on plant growth and nutrition, in R. Pinton, Z. Varanini, and P. Nannipieri (eds.), The Rizosphere, Marcel Dekker, Basel, pp.141-158.
60. Clapp, C.E., Chen, Y., Hayes, M.H.B. and Cheng, H.H. (2001) Plant growth promoting activity of humic substances, in R.S. Swift and K.M. Sparks (eds.), Understanding and managing organic matter in soils, sediments, and waters, IHSS, Madison, pp. 243-255.
61. Sánchez-Sánchez, A., Sánchez-Andreu, J., Juárez, M., Jordá, J. and Bermúdez, D. (2002) Humic substances and amino acids improve effectiveness of chelate FeEDDHA in lemon trees, J. of Plant Nutr. 25, 2433-2442.
62. Cincerová, A. (1964) The effect of humic acid on transamination in winter wheat plants, Biol Plant (Prague) 6, 183-188.
63. Olsen, C. (1929) On the influence of humus substances on the growth of green plants in water culture, C.R. trav. Lab. Carlsberg. 18, 1-16.
64. Sladký, Z. (1965) Die durch Blattduengung mit Humusstoffen bervorgerufen anatomischen une physiologischen Veraenderungen der Zuckerruebe, Biol. Plant (Prague) 7, 251-260.
65. Visser S.A. (1986) Effects of humic substances on plant growth, in Humic substances effect on soil and plants, Italy, Reda, pp. 89-135.
66. Muscolo, A., Felici, M., Concheri, G. and Nardi, S. (1993) Effect of earthworm humic substances on esterase and peroxidase activity during growth of leaf explants of Nicotiana plumbaginifolia, Biol.Fertil. Soils 15, 127-131.
67. Rea, E. and Pierandrei, F. (1994) Effects of fertilization with humic acids on soil and metabolism: a multidisciplinary approach, in N. Senesi, T. M. Miano (eds.), Humic substances in the global environment and implications to human health, Elsevier Science, Amsterdam, pp. 343-348.
68. Cozzi, R., Nicolai, M., Perticone, P., De Salvia, R. and Spuntarelli, F. (1993) Desmutagenic activity of natural humic acids: inhibition of mitomycin C and maleic hydrazide mutagenicity, Mutat. Res. 299, 37-44.
69. Genevini, P.L., Saxxhi, G.A. and Borio, D. (1994) Herbicide effect of atrazine, diuron, linuron and prometon after interaction with humic acids from coal, in N. Senesi and T.M. Miano (eds.), Humic substances in the global environment and implications on human health, Elsevier Science, New-York, pp. 1291-1296.
70. Cooper, R.J., Liu, C. and Fisher, D.C. (1998) Influence of humic substances on rooting and nutrient content of creeping bentgrass, Crop Sci. 38,1639-1644.
71. Ferrara, G., Loffredo, E., Simeone, R. and Senesi, N. (2000) Evaluation of antimutagenic and desmutagenic effects of humic and fulvic acids on root tips of Vicia faba, Environ. Toxicol. 15, 513-517.
72. YuLing, C., Min, C., YunYin, Li and Xie, Z. (2000) Effect of fulvic acid on ABA, IAA and activities of superoxide dismutase and peridoxase in winter wheat seedling under drought conditions, Plant Physiol. Com. 36, 311-314.
73. Haynes, R.J. and Mokolobate, M.S. (2001) Amelioration of Al toxicity and P deficiency in acid soils by additions of organic residues: a critical review of the phenomenon and the mechanisms involved, Nutrient Cycling in Agroecosystems 59, 47–63.
74. Zhorina L. V. and Stepchenko L. M. (1991) The content of free amino acids in the tissues of broiler chicks administered sodium humate in the ration, Nauchnye Dokl. Vyss. Shkoly Biol. Nauki 10, 147- 150.
75. Lange, N., Golbs, S. and Kuhnert, M. (1987) Grundlagenuntersuchungen zu immunologishen Reaktionen an der Laboratoriumstratte unter dem Einflus von Huminsauren, Arch. Exper. Veter.-Med. 41, 140-146.
76. Sato, T., Ose, Y. and Nagase, H. (1986) Desmutagenic effect of humic acid, Mutat. Res. 162, 173-178.
77. Sato, T., Ose, Y., Nagase, H. and Hayase, K. (1987) Mechanism of desmutagenic effect of humic acid, Mutat. Res. 176, 199-204.
78. Carlberg, G.E., Martinsen, K., Kringstad, A., Gjessing, E., Grande, M., Källqvist, T. and Skare, J.U. (1986) Influence of aquatic humus on the bioavailability of chlorinated micropollutants in Atlantic salmon, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 15, 543-548.
79. Humic acids and their sodium salts (1999) Summary report, February, The European Agency for the evaluation of medical products, Committee for veterinary medical products, (EMEA/MRL) 554/99-FINAL.
80. Ribas, G., Carbonell, E., Creus, A., Xamena, N. and Marcos, R. (1997) Genotoxicity of humic acids in cultured human lymphocytes and its interaction with the herbicides alachlor and maleic hydrazide, Environ. Mol. Mutagen. 29, 272-276.
81. Gau, R.J., Yang, H.L., Chow, S.N., Suen, J.L. and Lu F.J. (2000) Humic acid suppresses the LPSinduced expression of cell-surface adhesion proteins through the inhibition of NF-kappa B activation, Toxicol. Appl. Pharmacol. 166, 59-67.
82. Blondeau R. (1989) Biodegradation of natural and synthetic humic acids by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium, Appl. Environ. Microbiol. 55, 1282-1285.
83. Frimmel, F.H., Abbt-Braun, G., Hambsch, B., Huber, S., Scheck, S., and Schimiedel, U. (1994) Behaviour and functions of freshwater humic substances some biological, physical and chemical aspects, in N. Senesi and T.M. Miano, (eds.), Humic substances in the global environment and implications on human health, Elsevier Science, New-York, pp. 735-755.
84. Kirschner, R.A.Jr., Parker, B.C. and Falkinham, J.O.III. (1999) Humic and fulvic acids stimulate the growth of Mycobacterium avium, FEMS Microbiol. Ecol. 30, 327-332.
85. Dehorter, B. and Blondeau, R. (1992) Extracellular enzyme activities during humic acid degradation by the white rot fungi Phanerochaete chrysosporium and Trametes versicolor, FEMS Microbiol. Letter 94, 209-216.
86. Gramss, G., Ziegenhagen, D. and Sorge, S. (1999) Degradation of soil humic extract by wood- and soilassociated fungi, bacteria, and commercial enzymes, Microbiol. Ecol. 37, 140-151.
87. Hofrichter, D., Ziegenhagen, S., Sorge, R. U. and Bublitz, W. F. (1999) Degradation of lignite (lowrank coal) by ligninolytic basidiomycetes and their manganese peroxidase system, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 78-84.
88. Morimoto, K., Tatsumi K., Kuroda, K.-I. (2000) Peroxidase catalyzed co-polymerization of pentachlorophenol and a potential humic precursor, Soil Biol. Biochem. 32, 1071-1077.
89. Balarezo, A.L., Jones, V.N., Yu, H. and Hwang, H-M. (2002) Influence of humic acid on 1-aminopyrene ecotoxicity during solar photolysis process, Int. J. Mol. Sci. 3, 1133-1144.
90. Schiller, F., Klocking, R., Wutzler, P. and Farber, I. (1979) Results of an oriented clinical trial of ammonium humate for the local treatment of herpesvirus hominis (HVH) infections, Dermatoi Monatsschr 165, 505-509.
91. Mentel, R., Helbig, B., Klocking, R., Dohner, L. and Sprossig, M. (1983) Effectiveness of phenol body polymers against influenza virus A/Krasnodar/101/59/H2N2, Biochem. Acta 42(10), 1353-1356.
92. Schols, D., Wutzler, P., Klocking, R., Helbig, B. and De Clercq E. (1991) Selective inhibitory activity of polyhydroxcarboxylates derived from phenolic compounds agains human immunodeficiency virus replication, Acquir Immune Defic Syndr 4, 677-685.
93. Loya, S., Tal, R., Hizi, A., Issacs, S., Kashman, Y. and Loya, Y. (1993) Hexaprenoid hydroquinones, novel inhibitors of the reverse transcriptase of human iminunodeficiency virus type 1, J. Nat. Products 52, 2120-2125.
94. Polak, Z. and Pospisil, F. (1995) Alleviation of plant virus infection by humic acids, Biologia Plantarum 37, 315-317.
95. Laub, R. (1999) Process for preparing synthetic soil-extract materials and medicament based thereon, U. S. Patient No. 5 945 446.
96. Laub, R. (2000) Developing humate with anti-HIV, HSV, HPV and other antiviral activity, AntiviralDrug and Vaccine Development Information 12, Biotechnology Information Institute, p. 2.
97. David, P.P., Nelson, P.V. and Sanders, D.C. (1994) A humic acid improves growth of tomato seedlings in solution culture, J. Plant Nutr. 17, 173-184.
98. Dunstone, R.L., Richards, R.A. and Rawson, H.M. (1988) Variable responses of stomatal conductance, growth, and yield to fulvic acid applications to wheat, Aust. J. Agric. Res. 39, 547-553.
99. Leversee, G.J., Landrum, P.F., Giesy, J.P. and Fannin, T. (1983) Humic acids reduce bioaccumulation of some polycyclic aromatic hydrocarbons, Can. J. Fish. Aquat. Sci. 40, 63-69.
100. Stewart, A.J. (1984) Interactions between dissolved humic materials and organic toxicants, in K.E. Cowser (ed.), Synthetic fossil fuel technologies, Butterworth Publisher, Boston, pp. 505-521.
101. Oikari, A., Kukkonen, J. and Virtanen, V. (1992) Acute toxicity of chemicals to Daphnia magna in humic waters, Sci. Total Environ. 117/118, 367-377.
102. Steinberg, C., Haitzer, M., Hesse, S., Lorenz, R., Bueggemann, R. and Burnison, B.K. (1997) Change of bioconcentration and effect of pesticides in the presence of humic substances, Umweltwissenschaften und schadstoff-forschung 2, 64-68.
103. Filip, Z. and Berthelin, J. (2001) Analytical determination of the microbial utilization and transformation of humic acids extracted from municipal refuse, Fresenius J. Anal. Chem. 371, 675-681.
104. Filip, Z., Kanazawa, S. and Berthelin, J. (2000) Distribution of microorganisms, biomass ATP, and enzyme activities in organic and mineral particles of a long-term wastewater irrigated soil, J. Plant Nutr. Soil Sci. 163, 143-150.
105. Willmann, G. and Fakoussa, R.M. (1997) Biological bleaching of water soluble coal macromole-cules by a basidiomycete strain, Appl. Microbiol. Biotechnol. 47, 95-101.
106. Temp, U., Meyrahn, H. and Eggert, C. (1999) Extracellural phenol oxidase patterns during depolymerization of low-rank coal by three basidiomycetes, Biotechnol. Letters 21; 281-287.
107. Scheel, T., Holker, U., Ludwig, S. and Hofer, M. (1999) Evidence for and expression of a laccase gene in three basidiomycetes degrading humic acids, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 66-69.
108. Hofrichter, M. and Fritsche, W. (1997) Depolymerization of low-rank coal by extracellular fungal enzyme systems. II. The ligninolytic enzymes of the coal-humic-acid-degrading fungus Nematoloma frowardii b19, Appl. Microbiol. Biotechnol. 47, 419-424.
109. Götz, G. K. E. and Fakoussa, R. M. (1999) Fungal biosolubilization of Rhenish brown coal monitored by Curie-point pyrolysis/gas chromatography/mass spectrometry using tetraethylammonium hydroxide, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 41-48.
110 Fakoussa, R. M. and Frost, P. J. (1999) In vivo-decolorisation of coal-derived humic acids by laccase excreting fungus Trametes versicolor, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 60-65.
111. Ralph, J.P. and Catcheside, D.E.A. (1997) Transformations of low rank coal by Phanerochaete chrysosporium and other wood-rot fungi, Fuel Process Technol. 52, 79-93.
112. Cohen, M.S., Bowers, W.C., Aronson, H. and Grey, E.T. (1987) Cell-free solubilization of coal by Polyporus versicolor. Appl. Environ. Microbiol. 53; 2840-2844.
113. Steffen, K.T., Hatakka, A. and Hofrichter, M. (2002) Degradation of humic acids by the litterdecomposing Basidiomycete Collybia dryophila, Appl. Environ. Microbiol. 68, 3442-3448.
114. Holker, U., Ludwig, S., Scheel, T. and Hofer, M. (1999) Mechanism of coal solubilization by the deuteromycetes Trichoderma atroviride and Fusarium oxysporum, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 57-59.
115. Call, H.-P. and Mücke, I. (1997) History, overview and applications of mediated lignolytic systems especially laccase-mediator-systems (lignozym(R)-process), J. Biotechnol. 53,163–202.
116. Cozzolino, A. and Piccolo, A. (2002) Polymerization of dissolved humic substances catalyzed by peroxidase, Effects of pH and humic composition, Org. Geochem. 33, 281-294.
117. Fakoussa, R. M. and Hofrichter, M. (1999) Biotechnology and microbiology of coal degradation, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 25-40.
118. Prát, S. (1963) Permeability of plant tissues to humic acids, Biol. Plant (Prague) 5, 279-283.
119. Phoung, H.K. and Tichy, V. (1976) Activity of humic acids from peat as studied by means of some growth regulator bioassay, Biol. Plant (Prague) 18, 195-199.
120. Kulikova, N.A., Dashitsyrenova, A.D., Perminova, I.V. and Lebedeva G.F. (2003) Auxin-like activity of different fractions of coal humic acids, Bulgarian J. Ecolog. Sci. 2(3-4), 55-56.
121. Nardi, S., Panuccio, M.R., Abenavoli, M.R. and Muscolo, A. (1994) Auxin-like effect of humic substances extracted from faeces of Allobophora caliginosa and A. Rosea, Soil Biol. Biochem. 26, 1341-1346.
122. Muscolo, A., Bovalo, F., Gionfriddo, F. and Nardi, S. (1999) Earthworm humic matter produces auxinlike effects on Daucus carota cell growth and nitrate metabolism, Soil Biol. Biochem. 31, 1303-1311.
123. Muscolo, A., Cutrupi, S. and Nardi, S. (1998) IAA detection in humic acids, Soil Biol. Biochem. 30, 1199-1201.
124. Nardi, S., Pizzeghello, D., Muscolo, A. and Vianello, A. (2002) Physiological effects of humic substances on higher plants, Soil Biol. Biochem. 34, 1527-1536.
125. Vigneault, B., Percot, A., Lafleur, M. and Campbell, P.G.C. (2000) Permeability changes in model and phytoplankton membranes in the presence of aquatic humic substances, Environ. Sci. Technol. 34, 3907-3913.
126. Gerritsen, J. and Bradley, S.W. (1987) Electrophoretic mobility of natural particles and cultured organisms in fresh water, Limnol. Oceanogr. 32, 1049-1058.
127. Parent, L., Twiss, M.R. and Campbell, P.G. (1996) Influences of natural dissolved organic matter on the interaction of aluminum with the microalga Chlorella: a test of the free-ion model of trace metal toxicity, Environ. Sci. Technol. 30, 1713-1720.
128. Campbell, P.G., Twiss, M.R. and Wilkinson, K.J. (1997) Accumulation of natural organic matter on the surfaces of living – cells implications for the interaction of toxic solutes with aquatic biota, Can. J. Fish. Aquat. Sci. 54, 2543-2554.
129. Visser, S.A. (1985) Physiological action of humic substances on microbial cells, Soil Biol. Biochem.17, 457-462.
130. Fein, J.B., Boily J.-F., Guclu, K. and Kaulbach, E. (1999) Experimental study of humic acid adsorption onto bacteria and Al-oxide mineral surfaces, Chem. Geol. 162, 33-45.
131. Zhou J.L. and Banks C. J. (1993) Mechanism of humic acid colour removal from natural waters by fungal biomass biosorption, Chemosphere 27, 607-620.
132. Samson, G. and Visser, S.A. (1989) Surface-active effects of humic acids on potato cell membrane properties, Soil Biol. Biochem. 21, 343-347.
133. Visser, S.A. (1982) Surface active phenomena by humic substances of aquatic origin, Rev. Fr. Sci.Eau. 1, 285-296.
134. Ermakov, E.I, Ktitorova, I.N. and Skobeleva, O.V. (2000) Effect of humus acids on the mechanical properties of cell walls, Rus. J. Plant Physiol. 47, 518-525.
135. Malcom, R.E. and Vaughan, D. (1979) Humic substances and phosphatase activities in plant tissues, Soil Biol. Biochem. 11, 65-72.
136. Xu X. (1986) The effect of foliar application of fulvic acid on water use, nutrient uptake and yield in wheat, Aust. J. Agric. Res. 37, 343-350.
137. Pinton, R., Cesco, S., De Nobili, M., Santi, S., and Varanini, Z. (1998) Water- and pyrophosphateextractable humic substances fractions as a source of iron for Fe-deficient cucumber plants, Biol. Fertil. Soils 26, 23-27.
138. Santi, S., Pinton, R., Cesco, S., Agnolon, F. and Varanini, Z. (1999) Water-extractable humic substances enhance iron deficiency responses by Fe-deficient cucumber plants, Plant Soil 210, 145- 157.
139. Singh, A.K., Dhar, P. and Pandeya, S.B. (1998) Influence of fulvic acid on transport of iron in soils and uptake by paddy seedlings, Plant Soil 198, 117-125.
140. Stevenson, F.J. (1991) Organic matter-micronutrient reactions in soil, in J.J. Morevedt, F.R. Cox, L.M. Shuman, and R.M. Welch (eds.), Micronutrient in agriculture Soil Science, Soc. of America, Madison, pp. 145-186.
141. Maggioni, A., Varanini, Z., Nardi, S. and Pinton, R. (1987) Action of soil humic matter on plant roots: stimulation of ion uptake and effects on (Mg2+ + K+) ATPase activity, Sci. Total Environ. 62, 355-363.
142. Pinton, R., Varanini, Z., Vizotto, G. and Maggioni, A. (1992) Soil humic substances affect transport properties of tonoplast vesicles isolated from oak roots, Plant Soil 142, 203-210.
143. Varanini, Z., Pinton, R., De Biasi, M.G., Astolfi, S. and Maggioni, A. (1993) Low molecular weight humic substances stimulate H+-ATPase activity of plasma membrane vesicles isolated from oat (Avena sativa L.) roots, Plant Soil 153, 61-69.
144. Lowe, L.E. (1992) Studies on the nature of sulfur in peat humic acids from Froser river delta, British Columbia, Sci. Total Environ. 113, 133-145.
145. Ramalho, J.C., Lauriano, J.A. and Nunes, M.A. (2000) Changes in photosynthetic performance of Ceratonia siliqua in summer, Photosynthetica 38, 393-396.
146. Sollins, P., Homann, P. and Caldwell, B.A. (1996) Stabilization and destabilization of soil organic matter: mechanisms and controls, Geoderma 74, 65-105.
147. Bentez, E., Melgar, R., Sainz, H., Gomez, M. and Nogales, R. (2000) Enzyme activities in the rhizosphere of pepper (Capsicum annuum L.) grown with olive cake mulches, Soil Biol. Biochem. 32, 1829-1835.
148. Stemmer, M., Gerzabek, M. and Kandeler, E. (1998) Organic matter and enzyme activity of bulk soil and particle-size fractions of soils obtained after low-energy sonication, Soil Biol. Biochem. 30, 9-17.
149. Stemmer, M., Gerzabek, M. and Kandeler, E. (1999) Invertase and xylanase activity of bulk soil and particle-size fractions during maize straw decomposition, Soil Biol. Biochem. 31, 9-18.
150. Rao, M.A., Gianfreda, L., Palmiero, F. and Violante, A (1996) Interactions of acid phosphatase with clays, organic molecules and organo-miniral complexes, Soil Sci. 161, 751-760.
151. Kandeler, E., Stemmer, M. and Klimanek, E-M. (1999) Response of soil microbial biomass, urease and xylanase within particle-size fractions to long-term soil management, Soil Biol. Biochem. 31, 261-273.
152. Rosa, A.H., Vicente, A.A., Rocha, J.C. and Trevisan, H.C. (2000) A new application of humic substances: activation of supports for invertase immobilization, Fresenius J. Anal. Chem. 368, 730–733. H
153. Nannipieri, P., Ceccanti, B. and Bonmati M. (1998) Protease extraction from soil by sodium pyrophosphate and chemical characterization of the extracts, Soil Biol. Biochem. 30, 2113-2125.
154. Nemeth, K., Salchert, K., Putnoky, P., Bhalerao, R., Koncz-Kalman, Z., Stankovic-Stangeland, B., Bako, L., Mathur, J., Okresz, L., Stabel, S., Geigenberger, P., Stitt, M., Redei, G.P., Schell, J. And Koncz, C. (1998) Pleiotropic control of glucose and hormone responses by PRL1, a nuclear WD protein, in Arabidopsis, Genes Development 12, 3059-3073.
155. Wunderwald, U., Kreisel, G., Braun, M., Schulz, M., Jager, C. and Hofrichter, M. (2000) Formation and degradation of a synthetic humic acid derived from 3-fluorocatechol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 441-446.
156. Piccolo, A., Cozzolino, A., Conte P. and Spaccini, R. (2000) Polymerization of humic substances by an enzyme-catalyzed oxidative coupling, Naturwissenschaften 87, 391-394.
157. Yavmetdinov, I.S., Stepanova, E.V., Gavrilova, V.P., Lokshin, B.V., Perminova, I.V. and Koroleva, O.V. (2003) Isolation and characterization of Humin-like substances produced by wood-degrading fungi causing white rot, Appl. Biochem. Microbiol. (Russia) 39, 293-301.
158. Korotkova, E.I., Karbainov, Y.A. and Avramchik, O.A. (2003) Investigation of antioxidant and catalytic properties of some biologically active substances by voltammetry, Analyt. Bioanalyt. Chem. 375, 465-468.
159. Westerhoff, P., Aiken, G., Amy, G. and Debroux, J. (1999) Relatioships between the structure of natural organic matter and its reactivity towards molecular ozone and hydroxyl radicals, Wat. Res. 33, 2265-2276.
160. Danilov, R. and Ekelund, N.G.A. (2001) Effects of solar radiation, humic substances and nutrients on phytoplankton biomass in Lake Solumsjö, Sweden, Hydrobiologia 444, 203-212.
161. Lipski, M., Slawinski, J. and Zych, D. (1999) Changes in the luminescent properties of humic acids induced by UV radiation, J. Fluorescence 9, 133-138.
162. Fielding, M., D. Barcelo, A. Helweg, S. Galassi, L. Torstensson, P. Readman, J.W., T.A. Albanis, D. Barcelo, S. Galassi, J. Tronczynski, Van Zoonen, R. Wolter and G. Angeletti. (1992) Pesticides in ground water and drinking water, Water Pollut. Res. Rep. 27, p. 1-136.
YAZARLAR:
N.A. KULIKOVA, E.V. STEPANOVA, O.V. KOROLEVA
I. V. Perminova et al. (eds.)© 2005 Springer. Printed in the Netherlands.Use of Humic Substances to Remediate Polluted Environments: From Theory to Practice; 285-309.
http://www.mgumus.chem.msu.ru/publication/2005/kulikova-mitigating-05.pdf
